维生素D的测定方法

高效液相色谱法

1. 原理
　　样品中脂溶性维生素在皂化过程中与脂肪分离，以石油醚萃取后，用正相色谱柱提取富集，用反相色谱柱，紫外检测器定量测定。

2. 适用范围
　　本方法来源于GB/T 5413.9-1997。适用于婴幼儿配方食品和乳粉维生素A、维生素D、维生素E的测定；也适用于食品或强经食品及饲料中的维生素D含量的测定。

3. 主要仪器
1) 高压液相色谱仪，具有可变波长的紫外检测器，数据处理系统或记录仪。
2) 旋转蒸发器。
3) 平底烧瓶：250mL。
4) 分液漏斗：500mL。

4. 试剂
　　所有试剂，如未注明规格，均指分析纯，所实验用水均指蒸馏水。
1) 异丙醇：色谱纯。
2) 2％焦性没食子酸乙醇溶液：取2g焦性没食子酸溶液于100mL无水乙醇中。
3) 75％氢氧化钾溶液：取75g氢氧化钾溶于100mL水中。
4) 石油醚：沸程30～60℃。
5) 甲醇：色谱纯。
6) 正己烷：色谱纯。
7) 环己烷:色谱醇。
8) 维生素D标准溶液
A. 维生素D2标准贮备液：含维生素D2100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D2，用甲醇定容于100mL容量瓶中。
B. 维生素D3的标准贮备液：含维生素D3100mg/ml的甲醇溶液。称取10mg的维生素D3，用甲醇定容于100mL容量瓶中。

5. 操作步骤

5.1样品处理：准确称取10g样品，于250mL平底烧瓶中，加30mL蒸馏水。

5.2测定液的制备：
1) 于上述样品溶液中加入100mL的20％没食子酸乙醇溶液，充分混匀后加50mL75％氢氧化钾溶液，在蒸汽浴上边续回流30min后，立刻冷却到室温。
2) 将皂化液转入一500mL分液漏斗中，用100mL水分几次冲平底烧瓶。洗涤液并入分液漏斗中。
3) 于上述分液漏斗中，加入100mL石油醚，盖好瓶塞，倒置分液漏斗并剧烈振摇1 min.在振摇过程中，注意释放瓶内压力。静置分层，将水相放入另一500mL分液漏斗中，重复上棕萃取过程2次，合并醚液到第一个分液漏斗中。用蒸馏水洗该醚液至中性，通过无水硫酸钠过滤干燥，在40℃和氮气流下，于旋转蒸发器上蒸至近于（绝不允许蒸干）后，用石油醚转移至10mL容量瓶中，定容。
4) 从上述容量瓶中取7mL放入一试管中，用氮气将石油醚吹干，于试管中加1mL正己烷。

5.3测定：
1) 测定液的制备：
A) 仪器条件：
色谱柱：30cm×40cm，硅胶柱。
流动相：正己烷与环己烷按体积比1：1混合，并按体积分数0.8％加入异丙醇。
流速：1mL/min。
波长：265nm。
柱温：20℃。
灵敏度：0.005AU/MV。
注射体积：200mL。
B) 注射50mL维生素D标样和200mL样品溶液，根据维生素D标样保留时间收集维生素D于试管中，将试管用氮气吹干，准确加入0.2mL甲醇溶解。
2) 测定步骤：
A) 仪器条件：
色谱柱：4.6mm×25cm，C18或具同等性能的色谱柱。
流动相：甲醇。
流速：1mL/min。
波长：265nm。
柱温：20℃。
灵敏度：0.005AU/MV。
注射体积：50mL。
B) 注射50mL维生素D标准溶液，注射50mL样品溶液，得到标样和样品溶液中维生素D峰面积或峰高。

6. 计算

ρs×10∕7×40×100
X =
m
As
ρs= ---×ρsd
Asd
式中： X--样品维生素D的量，mg/100g；
m--称样量，含量，IU∕100g；
ρs --进样液中维生素D有浓度，mg/mL；
A s --进样液中维生素D有峰高（或峰面积）；
A s d --标样液中维生素D有峰高（或峰面积）；
ρsd --标样中维生素D的浓度；
计算结果精确至小数点后一位。

7. 注意事项
1) 允许误差及最小检出量：同一样品的2次测定值之差不得超过2次测定平均值的10％；最小检出量为0.1国标单位。
2) 试剂焦性没食子酸容易变性，应购习近期生产的试剂。
3) 如果皂化不完全，可适当增加氢氧化钾的加入量。