维生素A的测定方法

　　比色法

　　1.原理
　　维生素A在三氯甲烷中与三氯化锑相互作用，产生蓝色物质，其深浅与溶液中所含维生素A的含量成正比。该蓝色物质虽不稳定，但在一定时间内可用分光光度计于620nm波长处测定其吸光度。

　　2.仪器
　　实验室常用设备 分光光度计 回流冷凝装置

　　3.试剂
　　本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水
　　（1） 无水硫酸钠 Na2SO4
　　（2） 乙酸酐
　　（3） 乙醚 不含有过氧化物
　　（4） 无水乙醇 不含有醛类物质
　　（5） 三氯甲烷 应不含分解物，否则会破坏维生素A
　　检查方法：三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢和光气。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水振摇，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银溶液，如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物。
　　（6） 25%三氯化锑-三氯甲烷溶液 用三氯甲烷配制25%三氯化锑溶液，储于棕色瓶中（注意避免吸收水分）
　　（7） 50%氢氧化钾溶液（KOH） W/V
　　（8） 维生素A标准液 视黄醇（纯度85% Sigma）用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。
　　（9） 酚酞指示剂 用95%乙醇配制1%溶液

　　4. 操作步骤
　　维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行。

　　4.1样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。

　　(1)皂化法：
　　皂化：根据样品中维生素A含量的不同，称取0.5g～5g样品于三角瓶中，加入20～40ml无水乙醇及10ml1：1氢氧化钾，于电热板上回流30min至皂化完全为止。（皂化法适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部实验过程费时，且易导致维生素A 损失）
　　提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以30ml水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣子，可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内。用50ml乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30ml乙醚分二次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止。
洗涤：用约30ml水加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后，放去水层。加15 ～20ml 0.5mol/L氢氧化钾液于分液漏斗中，轻轻振摇后，弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。继续用水洗涤，每次用水约30ml，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止（大约洗涤3次）。醚层液静置10～20min，小心放出析出的水。
　　浓缩：将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25ml乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约5ml乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内。

　　(2)研磨法：
　　研磨：精确称2～5g样品，放入盛有3～5倍样品重量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。（研磨法适用于每克样品维生素A含量大于5～10μg样品的测定，如肝样品的分析。步骤简单，省时，结果准确）
　　提取：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入50～100ml乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，使样品中维生素A溶于乙醚中。使其自行澄清（大约需1～2h），或离心澄清（因乙醚易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先置于冷水浴中）。
　　浓缩：取澄清提取乙醚液2～5ml，放入比色管中，在70～80℃水浴上抽气蒸干。立即加入1ml三氯甲烷溶解残渣。

　　4.2标准曲线的制备:准确取一定量的维生素A标准液于4～5个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取1ml三氯甲烷和标准系列使用液1ml，各管加入乙酸酐1滴，制成标准比色列。于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色列按顺序移入光路前，迅速加入9ml三氯化锑-三氯甲烷溶液。于6秒内测定吸光度，将吸光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图。

　　4.3样品测定:于一比色管中加入10ml三氯甲烷，加入一滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加入1ml三氯甲烷，其余比色管中分别加入1ml样品溶液及1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。

　　6.计算
X = C/m×V×100/1000；
式中
X： 样品中含维生素A的量，mg/100g（如按国际单位，每1国际
单位= 0.3μg维生素A）；
C： 由标准曲线上查得样品中含维生素A的含量，μg/ml；
m： 样品质量，g；
V： 提取后加三氯甲烷定量之体积，ml；
100： 以每百克样品计。